CML(慢性骨髓性白血病) 致病蛋白BCR/ABL Fusion Protein 之結構以及功能

CML 治病機制：預覽

    BCR/ABL Fusion Protein 的產生來自於第9對和第22對的染色體產生Reciprocal Translocation，在第22對染色體上ABL (A tyrosine kinase)和BCR gene 接合在一起，形成所謂的Philadelphia Chromosme，而在95%的CML病人中都可以觀察到有Philadelphia Chromosome的存在。

正常人中ABL kinase 的結構與功能

(1) c-ABL 的重要結構和功能區域(Functional domain)

    CML的病因被主要歸因于BCR/ABL Fusion Protein的產生，那在探討治病機制時，正常情況下ABL kinase（C-ABL）和CML病患的ABL kinase(V-ABL)的比較便是研究CML致病原因的重點。ABL gene 上，有三個主要的domain，也就是表現ABL kinase所屬的Src family kinase的特性的domain: Src Homology Domain（SH1, SH2, SH3）。其中，SH1負責表現ABL 的kinase activity，而SH2 和SH3則是分別負責扮演促進還有抑制ABL kinase 的活性。值得注意的一點是，在c-ABL 的C terminal有一個Myristate Group，其負責的是ABL kinase的autoinhibition。

    BCR gene（Breakpoint Cluster Region）在人體中表現的生理功能尚未被發現，但是我們已知在許多白血病中，BCR會在許多地方產生斷點和ABL kinase 連接，例如在CML中，BCR會在p210的位置和ABL連接。

    觀察下圖ABL kinase的構造，可以發現在俱有磷酸化功能的區域是由許多α-helix的二級結構組成，而在SH2,SH3 domain 上，則有部分為組成β-sheet 的二級結構。

    為了方便說明，以下用簡圖示意ABL kinase的整體構造，在此僅標示出幾個重要的Functional Domain，也就是上述提到的Src Homology Domain還有Myristoyl group。左圖是ABL kinase 的inactive form，右圖則是active form，ABL kinase是否能夠活化的關鍵在於Myristoyl group的異相調控（Allosteric inhibition），Myristoyl group在ABL kinase的inactive form會bind 在Myristate binding pocket 上面，借此達到ABL kinase的autoinhibition的效果，而SH2,SH3在此也扮演了調控的角色，SH2會與αc patch 連接而使得Myristyol group離開Myristate binding pocket，可以促進ABL kinase的activation; 相對的SH3則是與Myristyol group相鄰，有抑制的效果。

(2) Myristoyl group 抑制ABL kinase的機制

    為了研究Myristyol group在抑制ABL kinase的活性上的機制，可以用下面的一個實驗解釋。在此實驗中，正常的ABL kinase分別和兩種藥物作用：GNF-2和DPH。此兩種藥物皆可以和Myristate binding pocket結合，但是兩者最大的差別在於前者能夠使Myristate binding pocket中的α1 helix產生bending，而後者不能，由於兩者藥物都會和Myristoyl group競爭Myristate binding pocket，但是卻只有GNF-2能夠對ABL kinase 產生inhibition的效果，因此可以得知：使得ABL kinase被抑制的關鍵之一在於使Myristate binding pocket 的α1’ helix產生bending。

BCR/ABL Fusion Protein在CML病患中失調的機制

    了解正常人體中的ABL kinase，有助於讓我們進一步找出在CML病患中，BCR/ABL Fusion Protein不正常的autophosphorylation是如何發生的。根據上述介紹，原因可以歸類為下列兩點：

(1) Lost of autoinhibitors

(2) BCR causes the active dimerization of BCR/ABL fusion protein

    從上圖可以發現，BCR和ABL結合時，ABL上的Myristate group會斷裂消失，所以導致ABL kinase的autoinhibition失效，而一直處於活化狀態，使得下游的許多pathway不正常開啟。

    另外，這邊要強調的是位於BCR gene上的Oligomerization domain，BCR和ABL 結合之後會因為BCR上的Oligomerization domain和另外一個BCR/ABL Fusion Protein形成Dimer(Dimerization)，而進行Autophosphorylation，因此下文將會著墨于介紹BCR/ABL Fusion Protein 是借由Oligomerization domain形成Dimer後的結構特徵和功能。

    從上圖可以看到BCR上的oligomerization domain上有一個明顯的Heptad repeat，也就是7個amino acid形成的一個循環序列，其中的第1,4個amino acid 為疏水性的amino acid，這個序列特徵正是形成Coiled-coil region的重要特徵。

    上圖是兩個BCR/ABL Fusion Protein在BCR端Oligomerization domain形成的Dimer結構，藍色和黃色分別是一個BCR/ABL Fusion Protein monomer，兩者以N-shaped的方式聚合。兩者的α2 helix以antiparallel coiled-coil region的方式聚合（正是上文所提到的Heptad repeat所coding的區域），並且在α1 helix和α2 helix之間有Domain swapping的現象（附註1），並且在兩個helix中間有疏水性的amino acid(e.g. Phenylalanine, Tryptophan)產生interaction，形成aromatic core。

    上圖為兩個BCR/ABL Fusion Protein在BCR端Oligomerization domain形成的Dimer結構的Electrostatic surface potential圖，紅色的區域是Acidic amino acid，藍色的區域是Basic amino acid。可以發現這個Dimer在外側主要是親水性氨基酸的分佈，而Dimer interface則是以疏水性氨基酸居多．（可參見下圖）

    另外，BCR/ABL Fusion Protein 在人體中發現會以兩個Dimer 的方式進一步形成Tetramer。儘管形成Tetramer的機制還不是研究的很清楚，但是在實驗中有發現形成Tetramer時，兩者下游的Activation site會因此靠的更近（在Dimer中兩個BCR/ABL Fusion Protein的C-termini距離大約為60 Å，但是當形成Tetramer的時候則是大約為24 Å）。這個現象會使得kinase磷酸化的因為localization而效率更高，或許是BCR/ABL Fusion Protein Dimer在人體形成Tetramer的原因之一。

    總結以上，我們可以得知在CML病患中，BCR/ABL positive的細胞裏面，由於BCR/ABL Fusion Protein的不正常活化引起下游的pathway不正常開啟是致病的關鍵，而其中會導致BCR/ABL Fusion Protein不受調控的autophosphorylation是由於ABL translocate到BCR下游時Myristoyl group的消失，還有BCR片段中的Oligomerization domain使得BCR/ABL Fusion Protein 以Dimer的形式出現並且磷酸話彼此，了解BCR/ABL Fusion Protein Dimer的結構有助於我們進一步研發相關對應的分子藥物等等。

BCR/ABL Positive cell中細胞Adhesion的失調

    介紹完了BCR/ABL Fusion Protein的結構與功能後，接著在進入CML致病Mechanism之前，我們要先回顧一下CML的一些病徵。

(1) Hematopoietic stem cells 在發育不完全的情況下離開骨髓

(2) Progenitor cells在血液中大量的分化、生長，產生許多沒有功能的白血球

    從以上兩點，在細胞生物學的觀點來看，是細胞的Adhesion出現了問題，而事實上，在BCR/ABL Positive cells中，除了由於BCR/ABL Fusion Protein導致下游的一些transcriptional factor被不正常活化以外，也發現了在這些Hematopoietic stem cells的一些cell adhesion receptors 和細胞膜表面的ligand有異常，甚至是骨髓中Extracellular matrix 上的一些重要component 也有所異常。

    上圖為CML病患的Bone Marrow Biopsy。

    在BCR/ABL positive cells中發現有以下變異：

(1) altered receptor affinity for ligand

(2) abnormal receptor clustering

(3) decreased integrin–cytoskeleton complex formation

(4) abnormal actin polymerization and actin cytoskeleton organization

(5) reduced adhesion

(6) impaired transfer of proliferation-regulatory signaling

    這些與Cell adhesion的相關異常(附註2)，除了直接的影響了細胞在Cell-ECM Adhesion , Morphogenesis, Metastasis上的變異，也會借由細胞受器和胞外間質產生的inside-out signaling 和outside-in signaling，透過細胞骨架(Interaction of the integrin cytoplasmic domain with cytoskeletal elements)，影響細胞的生長還有分化，因此在研究CML中，這些細胞產生的一些Adhesion上的變異，都是十分值得關注的(附註3)。

附註：

附註1:

    Domain Swapping是兩個或以上的蛋白質分子彼此互換相似的domain，常見于Dimer形式的Protein的N或C Terminal。Domain Swapping又可分為兩種，一種是Open Oligomer，會形成linear form; 另一種為Closed Oligomer，會形成Cyclic form。詳見下圖：

附註2:

    BCR/ABL positive cells中，被發現有變異的Adhesion molecules有以下：

(1) Adhesion receptors: α4β1 and α5β1 integrin receptors, CD44, and selectins.

(2) Adhesive ligands: VCAM-1 and ICAM-1

(3) Extracellular matrix (ECM) components: Fibronectin, Thrombospondin,

and Hyaluronic acid.

附註3：

    目前在部分的CML病患中，施予IFN-α有助於使其細胞的分化受到調控，並且有效的控制發病症狀，但是也會連帶抑制正常的Progenitor cells的分化。

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