新一代登革熱救星？又一個調控發炎反應的神奇開關---CLEC5A (下)

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    前篇文章中提到，登革熱的嚴重出血熱症狀會對身體造成如此巨大傷害的原因並不在於病毒本身對身體的侵害，而是由於登革熱病毒引發身體免疫系統對其產生的不適當發炎反應引起。這些不適當的強烈發炎反應是由大量的細胞激素分泌，也就是所謂的細胞激素風暴的產生引起，以下再次摘錄上一篇文章的一些內容作為導讀：
    由於大量的TNF-α造成血管內皮細胞通透性上升，使得許多血漿滲進組織中執行免疫反應，造成血液容積下降，因而引發低血壓，嚴重時甚至會休克；而一些發炎性細胞激素(pro-inflammatory cytokine)，例如：IL-1、IL-6、IL-12等則是會活化巨噬細胞(Macrophage)、自然殺手細胞(NK cell)，而IL-16會活化CD4+T細胞，開啟後天免疫，除此之外，這些發炎性細胞激素也會提高身體溫度對抗病原菌，然而相對地也對身體的組織負擔很大。
    於是要了解登革熱病毒以及身體免疫作用的機制，必須從登革熱病毒感染的致病機制來一層一層剖析，從中找出扮演調控發炎反應的要角。
    經過前人的研究發現，樹突細胞(Dendritic cells)和巨噬細胞(Macrophages)兩者為登革熱病毒感染的初期目標，然而遭到感染的兩者命運卻大不相同。樹突細胞會在被登革熱病毒感染後進行細胞凋亡(Apoptosis)，而被感染的巨噬細胞則否，他們會繼續存活約45天左右，並且在被感染後的6小時分泌大量的細胞激素(Cytokine)以及趨化因子(Chemokines)。從上述的發現可以推論出巨噬細胞才是登革熱病毒感染後主要調控發炎性細胞激素的角色，至於登革熱病毒開啟發炎反應的機制，是藉由病毒外套膜上的分子和巨噬細胞膜表面上的PRR(Pattern recognition receptor)結合，PRR是免疫細胞上表面帶有的非專一性的受體，可以辨認病原體上帶有的一些分子成分(PAMP, pathogen associated molecular pattern)，或是細胞受損的一些分子訊號(DAMP, damage associated molecular pattern)，借由這些受體下游的蛋白質訊號傳遞，可以開啟許多不同的免疫功能。
圖片來源：https://www.researchgate.net/figure/Major-pattern-recognition-receptors-PRRs-and-their-corresponding-Candida-PAMPs-Candida_fig1_221754806

    在登革熱病毒和巨噬細胞的互動中，根據前人的研究，發現了DC-SIGN(dendritic-cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin)這個PRR，會跟登革熱病毒外套膜上的醣類結合，開啟下游的反應。而除此之外，作者也發現了CLEC5A(C-type lectin domain family 5, member A)又稱為MDL-1(Myeloid DAP12-associating lectin)這個受器也會與登革熱病毒的表面分子結合。
    DC-SIGN與CLEC5A這兩者受器，對於登革熱病毒進入巨噬細胞的治病機制都佔據了要角的位置，但是在作用上卻是有一些截然不同之處。
    在結合的機制上，DC-SIGN是受到鈣離子調控的，沒有鈣離子的情況下無法完整的結合；至於CLEC5A則否，其和登革熱病毒的結合不受到鈣離子的影響，在加入了EDTA（會螯合鈣離子的配位錯合物，使得鈣離子無法與其他分子互動）的情形下，結合能力並不受影響。
    接著便要進入探討下游訊息傳遞的機制。在登革熱病毒感染巨噬細胞的情況下，可以觀察到DAP12(12-kDa DNAX-activating protein)的磷酸化情形，而DAP12是一個已知的重要Adaptor protein(銜接蛋白，在訊號傳遞中，扮演受體向下游蛋白傳訊的角色，可藉由磷酸化的修飾作用調控)，與下游的脾酪氨酸激酶作用後會開啟PI3K-Akt路徑，導致最後細胞激素的產生。至於會造成DAP12磷酸化的角色，正是CLEC5A。透過利用shRNA(short hairpin RNA，可以在RNA層次結合到目標mRNA使其失去作用無法被轉譯) knockdown DC-SIGN還有CLEC5A，可以發現在knock down CLEC5A的情況下，DAP12的磷酸化表現大幅下降，而得到這個結論。

    由於DC-SIGN已知和登革熱病毒進入巨噬細胞有關，因此作者也重複對CLEC5A做相同的實驗，測試在CLEC5A knockdown的情況下，是否對病毒進入細胞和病毒顆粒的釋放產生影響，在Confocal microscope的觀察下，並無發現CLEC5A的knockdown對病毒的感染情形有顯著影響。從以上的實驗結果可以得知，CLEC5A主要是扮演了巨噬細胞被登革熱病毒感染後的訊息調控，而DC-SIGN則是和病毒進入細胞的路徑有關。
    最有趣的則是，在CLEC5A被knockdown的情況下，發現了巨噬細胞所分泌的發炎性細胞激素(Pro-inflammatory cytokines)分泌量大幅下降，包括了TNF-α、IL-6、IL-8、MIP-1α(Macrophage inflammatory protein-1α)、IP-10(Interferon-inducible protein)，這些發炎性細胞激素和DC-SIGN knockdown的巨噬細胞相比下，分泌量下降了許多。而在IFN-α的分泌上面，卻不受到CLEC5A knockdown的影響，這個結果十分令人振奮，說明了在抑制CLEC5A的表現下，會使得巨噬細胞調控的發炎反應受到抑制，而不影響其分泌抑制病毒增殖的干擾素。
    考量到先前提到的登革熱嚴重併發症之致病機轉「抗體依賴性免疫加強反應」 ( antibody dependent enhancement; ADE)，作者在模擬相同的條件下測試加入CLEC5A的單株抗體阻擋CLEC5A下游的傳訊，得到了TNF-α分泌減少而IFN-α不受影響，和先前實驗的結果概念相符，證實CLEC5A扮演了發炎反應的訊息調控角色而對於感染路徑較無影響。
    在細胞和分子層次上得到了許多發現後，作者進行了小鼠的動物實驗，可以發現在施打CLEC5A單株抗體的老鼠群和控制組相比，經過登革熱病毒感染後產生出血熱還有血漿滲漏的情形皆較為輕微，死亡率也大幅下降，得到了十分振奮人心的結果。
    登革熱一直是台灣面對的棘手疾病之一，目前在治療方法上也遇到了難以突破的瓶頸，在許多學者的努力下，有不少的相關疫苗也正在開發中，這篇文章介紹的CLEC5A分子作為調控登革熱感染的巨噬細胞調控發炎反應的關鍵受體，發現了抑制CLEC5A可以大幅減少發炎性的細胞激素分泌而不影響干擾素的作用下，可能會是在治療登革熱併發的嚴重出血熱時，以及在面對其他病毒性發炎反應導致的疾病中，治療的新興方向！

參考資料：
  1. Chen, Szu-Ting, et al. "CLEC5A is critical for dengue-virus-induced lethal disease." Nature 453.7195 (2008): 672.
  2. https://www.cdc.gov.tw/professional/info.aspx?treeid=15EA1948FFC4FA7A&nowtreeid=76DDBC8A6B579E13&tid=22E80FEA84673B00


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