高通量技術專題介紹：Micro-western array

    經過了一學期的學習後，使我對高通量技術相關的背景知識了解了許多，也激起了我對這方面學問的好奇心。日前恰好有機會聽到國衛院的褚志斌老師在他的演講中，介紹了Micro-Western array(MWA)的技術以及其在臨床或是研究的應用上的突破性，我認為十分有趣，因此將內容整理下來作為這門課帶給我的延伸收獲。

1.       背景介紹：

    Micro-Western array是一種Reverse phase array，有別於常見的ELISA或是Sandwich ELISA。ELISA和Sandwich ELISA是先將抗體固定在Plate上，再加入Lysate，用抗體bind目標的Cytokine或是目標蛋白質，為了讓結果可見，前者的方法會在結合蛋白上加入螢光標記或是放射線標定以便於分析，而後者則是使用帶有螢光或是帶有可以催化螢光產生的酵素的第二抗體，結合目標蛋白的另一個接位。然而，儘管這是現在許多進行分子生物研究最長使用的方法學之一，卻有一些限制點。第一，在ELISA中，若是加入螢光蛋白或是放射線標定，都有可能改變蛋白質的結構，若這個結構恰好是抗體結合部位時，便很有可能無法結合，造成偽陰性的結果。在Sandwich ELISA中，最大的困難點在於抗體本身的設計不易，在目標蛋白上設計出兩個不同結合位的抗體更是一件大工程，有時不一定能夠成功。

2.       Micro-Western array的突破：

    Reverse phase array 將Lysate固定在晶片上，利用高專一性的抗體去標定目標蛋白，而有別於Forward phase array的做法，不同的方法學都有各自的弱點，這些限制也促使了更多不同的array的發展，其中一項便是Micro-Western array的發明。

    就如同前面所說的，每種方法學都有自己本身的限制，Reverse protein array 最大的問題是當目標蛋白在Western blot的時候會產生一條以上的band，在Reverse protein array下則會有相當大的誤差，這個現象發生的可能是由於Lysate都是點在同一個點上，也就是所謂的dot blot，不同條的band沒有辦法分離，只能看出總體發出的螢光強度，但是卻無法分辨是不是目標蛋白的那一條band發出來的，很有可能會有false positive的情形發生。而在一篇研究中，同一組實驗在利用傳統的Western blot和Reverse protein array的操作下，觀察到了許多在Western blot下發現蛋白質隨著時間有顯著不同的表現量，這個結果卻在Reverse protein array下無法被發現，也點出了蛋白質需要被分離的關鍵，這也是Micro-Western array突破的最大關鍵。

3.       基本原理介紹：

    Micro-Western array在方法學上，也有許多不同之處。首先是有別於傳統的array，Micro-Western array將Lysate或是檢體處理完後利用GeSim Nano Plotter arrayer將其點在SDS Page上，而不是玻璃晶片。這片客製化的膠有96個Well，每一個Well上面都有一個Protein marker和六個Sample，加入後進行乾燥式電泳後將其分開並且Transfer到Nitrocellulose membrane上，96個Well可以利用特殊橡皮隔開，因此能夠在每一個Well中加入不同的抗體，也就是最多能夠同時看到96種抗體的變化，效率十分的高。由於分析的樣本非常小，所以無法用傳統洗底片的方式洗出來，因此需要藉由Licor Odyssey infrared scanner去解析結果，其解析度等級至µl，完成一次的實驗流程，其內容和步驟與傳統Western blot大同小異。

（上圖為GeSim Nano Plotter arrayer）

（上圖為Licor Odyssey infrared scanner）

4.       Micro-Western array的優勢：

    Micro-Western array最大的優點莫非是其為一種高通量的技術，除了效率高之外，做出來的結果和傳統的western blotting一致，而且每個”Micro-Western blotting”只需要0.2µl的抗體，和50nl的sample。而array一次四個小時最多可以印兩片膠，也就是192個western blotting，一共是1152個sample點，每個“Micro-Western blotting”可以用不同的抗體分，因此最多可用192種抗體進行實驗，每種0.2µl。跟傳統一樣，這整個過程，包含transfer、 Blocking、washing、 2nd antibody，需要兩天，數據分析約需要2-3天。因此一周的時間，一個人利用Micro-Western Array作的western blotting的工作量約是傳統western blotting工作24周，也就是差不多半年的工作量。這種新的技術，可以用極少量的sample和antibody分析大量數目不同蛋白質的變化，極適合研究幹細胞、癌細胞、組織發育等過程中的signaling transduction pathway的變化。

    至於在結果的分析上利用Licor Odyssey infrared scanner的優點有兩者，第一點在於測量範圍內皆為線性變化，所以測出的亮度會正比於蛋白質濃度，可以很容易從亮度去推算出其他點的濃度。第二個優點在於保存性，由於加入的是以接收近紅外線的二級抗體，在沒有接觸到光的情況下可以保存的十分良好，不容易衰退。

Micro-Western array之優勢
	優點1	優點2
實驗技術	效率高；正確率高	節省Sample或抗體耗量
結果分析	線性結果；預測性佳	樣品保存性良好

5.       心得：

    Micro-Western array的技術突破了在Reverse phase protein microarray上遇到的許多瓶頸，雖然整體的原理十分的直觀，但是在開發的過程中面對許多技術上的細節卻也是充滿了巧思。我認為高通量技術的進步除了最直接的在實驗上大幅增加了效率，也相對的會逐漸增加實驗的準確度，透過機器的精密操作增加實驗的一致性。

    另外，除了技術以及儀器的進步外，與高通量技術相輔相成的便是數據分析的能力。伴隨著高通量技術的進步，所產生的大量數據也非傳統統計方法都能夠應付的，也因此在數據分析上必須時時進步，在海量的數據中找出最可貴的資訊。這兩者的關係就好比是雙腳，一腳向前跨出後，另一腳也必須往前跨步，才能夠使整體保持前行，否則只能滯留原地。未來我相信不論是在癌症的研究方面，或是基因體研究方面，像是這次所介紹的Micro-Western array等持續創新的高通量技術都會是能夠使得研究者持續向前突破的關鍵之